在轉基因和敲除研究中，維持多能性對利用小鼠胚胎干(ES)細胞至關重要。已經發(fā)現(xiàn)許多因子可以影響ES細胞的多能性,其中之一就表現(xiàn)在白血病抑制因子（LIF）對ES細胞培養(yǎng)的影響。關于抑瘤素M（OSM）能補償LIF在ES細胞培養(yǎng)中的作用，對此存在不一致的報道。一些研究提示在維持ES細胞多能性方面，OSM不如LIF有效。然而，其他研究發(fā)現(xiàn)它們是等效的。在本研究中，我們證明在維持ES細胞多能性上，人OSM擁有與小鼠LIF相類似的功效，包括長期（超過10天）維持多能性、體外分化的能力、活化STAT3的能力和種系傳遞能力。我們的研究提示OSM可能是在早期胚胎發(fā)育中發(fā)揮作用的另一種因子，并且在小鼠ES細胞培養(yǎng)時，OSM可以被用作LIF的替代物。

抑瘤素M維持未分化ES細胞的形態(tài)

圖1：LIF或OSM中長期培養(yǎng)后的細胞形態(tài)比較。（圖A，C），細胞培養(yǎng)于103 U/mL的LIF中。（圖B，D），細胞培養(yǎng)于10 ng/mL的OSM中。圖A和圖B是生長于輻射照過MEF細胞上的細胞，圖C和圖D是生長于明膠包被平板上的細胞。

圖像攝于第6代，然而，細胞在OSM培養(yǎng)基中可以連續(xù)25代維持未分化形態(tài)。箭頭所指是具有未分化形態(tài)的ES細胞克隆。所有圖片在200倍鏡下拍攝。

材料和方法

細胞培養(yǎng)：CJ7 ES細胞系由Tom Gridley贈予。高葡萄糖DMEM培養(yǎng)基另加15%胎牛血清（FBS），4 mM谷氨酰胺，10 μM ，1% MEM非必需氨基酸，每毫升50 IU青霉素，每毫升50 μg鏈霉素，和每毫升103 U的LIF （ESGRO；Chemicon，Temecula CA）或者10 ng/mL的抑瘤素M（R&D Systems，目錄#295-OM），以此培養(yǎng)ES細胞。細胞生長于輻射照過的小鼠胚胎滋養(yǎng)細胞（MEFs）上或者0.1%明膠包被的平板上。細胞每兩天傳代一次。

把106個細胞傳到含有10%FBS，每毫升50 IU青霉素，每毫升50 μg鏈霉素，4 mM谷氨酰胺和DMEM培養(yǎng)基的6孔組織培養(yǎng)皿中，以此制備類胚體（EBs）。用培養(yǎng)基沖洗培養(yǎng)皿，分離細胞團。把細胞團轉移至有蓋培
養(yǎng)皿，然后每天更換培養(yǎng)基。要進行分化時，懸浮培養(yǎng)EBs 4至6天，然后轉移0.1%明膠包被的24孔板，讓細胞貼板生長7天，再進行免疫細胞化學實驗或為RT-PCR提取RNA。

RT-PCR：用RNAeasy試劑盒（Qiagen），根據(jù)產品說明書從未分化的ES細胞和分化的EBs中提取RNA。使用Superscript First-Strand Synthesis System（Invitrogen），根據(jù)產品說明書，500 ng RNA通過隨機六聚體引物進行逆轉錄。2 μL cDNA用作擴增模板。所有引物在55℃下退火，擴增35個循環(huán)。

免疫細胞化學：所用一抗（rtxh/mOct3/4；mxh/mSox2；gtxmNanog；mxβIIITubulin；mxhTroponinT和gtxhHNF3β）購于R&D Systems。細胞或EBs轉養(yǎng)到24孔板中的蓋玻片上。在室溫下用4%多聚甲醛固定細胞20分鐘，然后將細胞在含有1%BSA（PBA）的PBS中洗4次。用含有PBA溶解的0.1%Triton X-100的10%驢血清封閉細胞45分鐘。然后加入10 μg/mL的一抗，孵育3個小時，之后把細胞在PBA中清洗三次，每次洗5分鐘。然后，用5 μg/mL的NothernLightsTM557連接的二抗（R&D Systems）孵育細胞1個小時，然后如上清洗細胞。

STAT3活化水平：用Active STAT3 DuoSet IC試劑盒（R&D Systems）檢測STAT3的活化水平。根據(jù)試劑盒說明書，用生長于或未生長于MEFs上的未分化ES細胞制備細胞核提取物。用Bradford檢測對蛋白質進行定量分析。STAT3活化水平根據(jù)產品說明書而確定，然后根據(jù)總蛋白水平進行標準化處理。

小鼠嵌合體的生物試劑：所有程序由密西根大學動物使用和照顧委員會批準。根據(jù)國家研究委員會關于實驗動物照顧和使用指南概述的原則和程序對動物提供照顧。在含有LIF或者OSM的培養(yǎng)基中連續(xù)傳代5次后，用胰蛋白酶處理細胞，然后將16個ES細胞顯微注射到囊胚中。囊胚取自與C57BL/6J X DBA/2J/F1雄小鼠（The Jackson Laboratory，Bar Harbor，ME）交配的超數(shù)排卵的C57BL/6NCrl雌小鼠（Charles River Laboratories，Wilmington，MA）。注射當天，用標準方法把顯微注射的囊胚轉移到假孕的受體雌鼠體內。用嵌合體與C57BI/6J雌鼠交配來檢測種系傳遞。

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